用好HPLC的九大关键问题

由于具有高速度、高分离效果、高灵敏度等优点,近年来,HPLC的应用发展非常神速。目前,几乎所有需要分离的大分子有机物分析工作,它都可以发挥优势。可以预言,HPLC仪器的应用,将在“农、轻、重、海、陆、空,吃、穿、用”等各个领域、各行各业无所不在、无所不有。
但是,如何用好HPLC是一个非常关键的问题。基于作者的长期实践,以下从仪器学理论、分析误差理论、分析化学等多个角度来全面讨论。

1、泵、柱、检测器三者的关系的认识和目前使用者普遍存在的问题

  目前很多研发、使用HPLC的科技工作者,没有搞清楚或没有完全搞清楚HPLC中的泵、柱、检测器三者的关系。国内外很多生产厂商只是生产泵、检测器,色谱柱子都是外购件。我们说HPLC是一个系统,是指泵、柱、检测器三者组成的一个完整的系统。如果只生产泵、检测器,就不能说是生产完整的HPLC仪器,只是生产了HPLC的两种部件,再买一根色谱柱组装成一台仪器后出售。所以,这样生产的HPLC系统,到了用户那里,总是不好用或者不大好用。而广大使用者,由于没有将HPLC的泵、柱、检测器三者互相影响的关系搞清楚,所以不能将HPLC用到最佳水平(得到误差最小的最佳分析检测数据)。以本人长期的研发和使用HPLC的实践经验,认为研发、使用HPLC时,以下问题特别值得注重:

  正确认识、处理HPLC的泵、柱、检测器三者的关系:

  (1) HPLC是一个系统,必须将泵、柱、检测器三者(三个部件)结合起来才能叫HPLC。三者都合格,联机后的整机系统才有可能合格,但不能肯定系统就会合格。只有泵、柱、检测器三者质量都合格,并且联机后检测结果也合格,才能说明这台HPLC是合格的。

  (2) 三个部件都重要,不能偏重哪一方面。三者谁是核心?谁最重要?目前,光谱、色谱工作者对此看法都各不相同、各有表述,我们不必去追究这些。作者认为应该说三者是一个整体,缺一不可,都很重要。

  (3)本人长期使用过HPLC,也研发过HPLC仪器,实践使本人深深认识到:必须将三个部件联接起来检验测试,并能达到质量指标要求,才能说这台HPLC达到了质量要求。否则,只能说是部件合格,而整机系统不一 定能合格。为什么? 因为:

  ①泵会因为柱子问题产生压力不稳、流量不稳定,会影响HPLC系统的质量;

  ②柱对泵影响很大:柱堵塞、柱沾污、柱接头漏液等,都会影响泵的压力波动、使流速不稳定,会影响系统不稳,使RSD变坏、峰拖尾、灵敏度降低;

  ③柱对检测器影响很大:柱效降低(柱塔板数降低)、柱堵塞、柱的新旧程度、接头、管道漏液等,都会影响检测器的检测限、分辨率、噪声、和灵敏度。

  请注意:色谱柱是易损件,用户会经常在色谱柱长时间使用后换新柱,此时HPLC系统的泵和检测器基本进入“电子元件失效理论”的盆底,比较稳定了。所以,不会因为换新柱而产生仪器不能使用的问题。特别应该指出的是:用户换新柱后,一般不检测系统的综合指标。如果检测指标,可能就不能达到原出厂指标(因为泵和检测器经过较长期使用后,质量会有所下降,旧泵、新柱、旧检测器三者不能达到最佳配备),但是不会影响使用。

  用户换新柱不会影响使用的问题,可以从计量认证标准规范(JJG)得到佐证。JJG检验的仪器,很多是在用仪器,它明确规定被检仪器的指标可以比新出厂的仪器指标低,甚至有些指标因为达不到要求而免检。但我们的制造企业,在仪器出厂前,必须检测系统的指标,只有系统指标达到设计要求时,才算合格,才能出厂。至于用户换新检测器、换新泵、同样都是允许的。

2、使用者应该对色谱柱及柱外的有关问题引起高度重视

  1)色谱峰拖尾:与柱、流动相的流速、试样等有关,发现拖尾一定要从这些方面查找原因;

  2)如何延长色谱柱寿命:保养很重要,长期不用时用甲醇浸泡着,严格控制洗柱时间或洗柱溶剂体积,一般经常使用的柱,下班时应该用甲醇(或水:甲醇为20:80)洗 45分钟或20倍床体积;

  3)必须注意对“柱外效应”的控制。所谓“柱外效应”,就是指HPLC系统中,除柱系统外,管路、连接件、进样器和流动池的死体积等引起的色谱峰增宽效应。

  4) 进样:自动进样时,应该经常检测自动进样器,对仪器进样器要求稳定可靠;手动进样时,应该特别注意取样时的细节,进样时的手感(轻、重、缓、急)等。

3、HPLC的使用者应该特别注重对色谱柱质量的判断

  1)色谱柱的柱效:塔板数高者好,特别要注意影响柱效的因素,塔板数降到一定程度该柱就报废了。

  2)重复性:一根柱子反复使用时,最好RSD能够保持小于0.1%。

  3)耐用性(寿命):因为柱效很容易降低,所以需要重视对柱的保护。

  4)色谱柱使用后一定要进行清洗,以免造成腐蚀、阻塞、降低塔板数。一般应该用20倍床体积冲洗,隔几天再用的HPLC,最好用20%甲醇:80%水冲洗30分钟左右后,再用纯甲醇冲洗20分钟 后保存。

4、HPLC的使用者应该特别重视流动相问题

  1)PH值特别重要:一般C18柱PH小于3时,容易损坏色谱柱,但是抗酸性的柱可以使用小的PH值。

  2) 注意选择试剂的截止波长:如乙腈截止波长215nm、丙酮截止波长330nm、正丁烷210nm等等(具体情况请读者参阅本文的参考文献)。

  3)流速:流速要适当,否则影响峰形、浪费溶剂,一般常规分析工作大多选择1ml/min。

5、使用者应该注重溶剂前处理

  最好使用HPLC级的优质溶剂,使用前必须过滤和脱气。注意以下几点:

  1)过滤目的:

  溶剂进泵前和样品注射前应该过滤除去溶剂中的微小颗粒、微生物,保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏,保证分析数据可靠。

  2)对过滤器的要求和最佳孔径选择方法:

  对过滤器总的要求:速度快、溶出度小、死体积小、精确的孔径、体积适当、化学兼容性好等。

  最佳孔径选择方法:如果色谱柱填料直径小于3µm或除菌过滤,一般选择0.2µm孔径;如果色谱柱填料直径大于5µm,则选0.45µm;如果是预过滤或过滤难过滤的样品,一般选1µm孔径。特别是对使用无机盐配制的缓冲液,更要注意选择合适的过滤器!否则,不可能得到可靠的分析测试数据!

  3)脱气:

  主要目的是:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。流动相的气泡进入液相泵会引起压力的上下波动,危害很大,必须除之,可以打开排空阀,大流速冲洗。

6、使用者应该注重缓冲液问题

  1) 缓冲液使用前必须过滤。

  2) 溶剂、样品易受到细菌和霉菌的影响,要注意清洁。

  3)一般不能直接用有机溶剂做清洗冲洗。

  4)梯度洗脱时,选低吸收值的缓冲液 :

  例如:梯度洗脱时,缓冲液与有机相应预混,以防止析盐。在保证峰不拖尾的情况下,尽可能选用低浓度的缓冲盐,防止析盐; 缓冲盐浓度,一般用20~30mM基本上就可以了,如果流动相中有机相含量高的话,流动相中的盐类缓冲液浓度就不能过高,盐的浓度起码要保证在流动相条件下不会析出。离子对缓冲液浓度要高一点,一般50~100mM。

7、研发者、使用者还特别需要重视12个常见的技术问题。

  这12个问题是作者的经验总结,是用好HPLC的科技工作者必须重视的问题。(请读者参考《李昌厚,高效液相色谱仪器及其应用,北京:科学出版社,2014》一书)。

8、使用者必须重视进样器的清洗问题

  进样器或进样针请注意三点:

  A、对进样器要求:自动进样和取样速度快、有些仪器进样时间仅17秒。

  B、进样室要求可控:一般用帕尔帖冷却,温控范围4℃~100℃。

  C、特别要应注意进样残留量的清洗(主要是清洗针):

用好HPLC的九大关键问题

洗针后,进样残留物由前面的0.07% 降到0.05%,结果非常好。

9、使用者应该重视HPLC的线性动态范围(Linear Dynanic Range-LDR)及其测试方法

  1)线性动态范围的定义

  HPLC检测器的线性动态范围定义如下图所示:

用好HPLC的九大关键问题

国际上科技工作者对HPLC的线性动态范围的定义是:最大线性区(保证1%相对误差的线性区域)的吸光度值Amax,除以最小线性区(保证1%相对误差的线性区域)的吸光度值Amin。即LDR=Amax/Amin;或最大线性区的浓度Cmax除以最小线性区的浓度Cmin,即LDR=Cmax/Cmin

  2)HPLC的线性动态范围的重要性(对分析测试误差的影响)

  定量分析检测时,如果HPLC使用在非线性动态区,肯定会因非线性而产生误差。为了保证分析测试结果的可靠性,我们应使用在HPLC的线性动态区。因此,线性动态范围是一切HPLC使用者必须高度重视的技术指标。

  一般来说,使用者拿到一台HPLC仪器后,总是希望对很稀的样品分析时,其分析测试的结果在所要求的误差范围内。对很浓的样品分析时,其分析测试的结果也在所要求的误差范围内。这就只有HPLC的线性动态范围很宽的时候才能做到。有人认为,样品太稀时,浓缩一下就好了,样品太浓时,稀释一下就是了。这是不了解分析工作或未亲自作过分析工作的人说的话。因为,浓缩一下或稀释一下谈何容易?首先是增加工作量,稀释或浓缩工作很麻烦;第二,稀释或浓缩会带来误差。所以我们总是希望HPLC的线性动态范围大(宽)且好。

  HPLC的线性动态范围,一般取决于仪器检测器的噪声和杂散光。国内外很多HPLC的生产厂商不给出HPLC的线性动态范围。作者认为不给线性动态范围是不对的,因为不给线性动态范围,就意味着不知道这台HPLC分析的样品浓度的上限和下限。综上所述,HPLC的线性动态范围非常重要,它将限制仪器的使用范围(即限制仪器的适用性)。很遗憾的是许多科技工作者目前还未对线性动态范围引起重视。

  3)线性动态范围测试方法

  HPLC的线性动态范围的测试方法有多种。我国的计量检定规程JJG705-2002规定:波长254nm时,采用“丙酮/2%异丙醇水溶液(丙酮含量为0.1%、0.2%、....1.0%)冲洗检测池,并记下各溶液对应的稳定记录仪读数;由CH/CL算出检测器的线性范围(CH浓度上限、CL浓度下限)。”作者认为这种方法很不妥。因为浓度的下限是计算出来的,不是真正测试出来的下限。采用的计算公式为:CL=2NCV/H×20(公式本身有错误);并且算出的下限值达到千万分之三点一(即:0.000031%)。这样的数据有什么意义?作者认为这种测试线性范围的测试方法既不符合仪器学理论,又不与国际接轨,有关部门应该尽快更正。

  目前,国际上对线性动态范围的测试方法,一般是配置不同浓度的标准样品(以数量级递增),直接在仪器上测试其吸光度。求出偏离比耳定律1%时的最大吸光度Amax和最小吸光度Amin。二者相除即是仪器的线性动态范围LDR(Linine Dinamic Rangi)。即LDR=Amax/Amin。其具体操作是:HPLC仪器设置纵坐标为吸光度A,横坐标为浓度C;检测器的光谱带宽为2nm;波长设置可以在紫外区(如要求很高时可设置在253.7nm),也可在可见区(如500nm);试样可任选,浓度从小到大,依次对所配试样进行测试。作曲线,从曲线上找出偏离线性在1%以内的范围。此范围内的Amax/Amin就是线性动态范围。

  作者在研发HPLC的UV/FLD时,就是根据仪器学理论,从线性动态范围的物理概念出发,自己配置蒽不同浓度的溶液,以数量级递增,测出能保证1%相对误差的下限点和上限点,二者相除,得出其线性动态范围,效果非常好。


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